對李贄的後半生影響重要，並在明代思想史上具有重要意義的事件，是他與耿定向（1524-1596年）的學術論爭。這是一場「反道統」與「衞道統」之爭，李贄從此被衞道之士迫害，最終惹來殺身之禍。
李贄是先認識耿定向之弟耿定理（1543-1584年），再結交耿定向的。隆慶五年（1571年），李贄離開北京，到南京任刑部員外郎。在此期間，他結交了終生摯友焦竑（1541-1620年）與耿定理。焦竑與李贄思想志趣相投，切磋學問，共論人生，相互引為知己，為晚明儒學史上的一段佳話。耿定理是湖北黃安人，李贄的女婿莊純夫曾就學於耿定理。隆慶六年（1572年），耿定理遊南京，與李贄結識，晤談甚歡，後來成為莫逆之交。
萬曆五年（1577年），李贄出任雲南姚安知府，途經黃安，順道探訪耿定理，因此結識了耿定理之兄耿定向。在黃安逗留期間，李贄與定理朝夕論道，融洽無間。李贄後來回憶說：「抵黃安見楚倥（定理），並睹天台（定向），便有棄官留住之意。楚倥見余蕭然，勸余復入（仕）。余乃留吾女並吾婿純夫於黃安，而因與之約曰：『待吾三年滿，收拾得正四品祿俸歸來為居食計，即與先生同登斯岸矣。』」
李贄在任三年期滿後，果然視富貴如浮雲，棄官回到湖北黃安，開始他的新生活。從萬曆九年（1581年）到十二年（1584年），李贄一直住在黃安耿定理家中，潛心讀書和著述。李贄住在耿家，雖受禮遇，但並沒有白吃耿家的飯，而是在耿家教授耿氏家庭的子弟，就像耿府請來的一個教書先生。在此期間，他與耿定理論學心心相契，而與重傳統名教的耿定向卻頗有齟齬。
耿氏兄弟論學不和。二人之間，李贄傾向耿定理，也曾從中作過調停。在《焚書》卷一〈與耿楚倥〉這封信中，李贄勸耿定理不要太看破紅塵，雖然「世間萬事皆假，人身皮袋亦假也」，但既然生而為人，身體一失調護，也就百病頓作，因此不可因其假而不加調攝；人生在世，自有人生的使命，不能只是如禪宗所說的「到處自在，隨時着衣吃飯度日」。
但是，李贄與耿定向論學更不投緣。他們的朋友周柳塘曾對耿定理談及李贄與耿定向論學的分歧，說：「天臺（耿定向）重名教，卓吾（李贄）識真機。」萬曆十二年（1584年），耿定理去世。這對李贄來說，絕對是一個沉重打擊，他感到悵然若失，難以支持。定理死後，再加上與定向論學的不合，使得李贄無法在黃安耿府繼續住下去。於是，他留下一紙〈與耿司寇告別〉，又派人護送妻女回福建原籍，居官俸祿也都盡數交給家屬，然後孑然一身，到湖北麻城龍湖芝佛院，日與僧人無念及友人周友山、楊定見等讀書、論道。
萬曆十八年（1590年），李贄把多年來與耿定向辯論的書信和文章，收入《焚書》，在麻城公開刊刻出版。這一下惹惱了耿定向，認為這是自己的奇恥大辱，於是公開作〈求儆書〉，動員他的門生「奮勇起而遏絕天下之惡聲」。由於耿定向當時位處顯要，登高一呼，他的門生蔡弘甫很快就寫了《〈焚書〉辯》，對李贄大肆攻擊。
李贄與耿定向同屬泰州學派，兩人的論爭是泰州學派的左、右派之辯。兩人的論爭焦點集中在「反道統」與「衞道統」、「不容己」與「童心說」。這場論爭成就了李贄。在論爭中，李贄的思想逐步成熟，許多著述應運而生；但這場學術論爭也被傳統統治階級所利用，變成對「異端」李贄的迫害。
從到麻城龍湖芝佛院起，李贄便「自稱流寓客子，既無家累，又斷俗緣，參求乘理，極其超悟。」（袁中道《李溫陵傳》）但是，由於他在芝佛院期間，著書談道，聽者日眾，並有女流聽講，這就給他招來流言蜚語，如「左道惑眾之類」。
由於《焚書》的刊行，耿定向及其門生一直耿耿於懷，伺機陷害李贄。萬曆二十四年（1596年），耿定向的門生巡道史族賢曾到麻城，以所謂李贄「大壞風化」為名，傳開了若李贄不迅速離開，就要治他罪的消息。這也是李贄不得不北上河南商城，後來又往北京通州的原因。
縱觀李贄與耿定向的分歧，主要是對待綱常名教的立場和態度，是如此的不相容。李贄與耿定向之間的矛盾，即非財產搶奪，也非名利傾軋，而是學術之辯、是非之辯。對於耿定向棄責自己為「異端」邪教，李贄則駁斥之：「妖言惑眾，我豈懼哉。」
