明代中葉，內憂外患交困，外交政策在「禁海」與「開海」之間長期搖擺不定，此時歐洲人已經由海上探險發現新航路，從海路長驅東來。葡萄牙位於歐洲西南面的伊比利亞半島西部。葡萄牙亨利王子（Henry the Navigator，1394—1460年）積極推動葡萄牙人航海事業，創辦航海學校，派人沿非洲西海岸南下探險。

1517年（明正德十二年），安德烈（Fernão Perez de Andrade）為發現中國總指揮，在葡萄牙國王使者皮萊資（Tomé Pires）的陪同下，向中國進發，到達屯門港，後進入廣州，1518年安德烈把皮萊資等七個葡人留在廣州等待明政府接見，自己則退回屯門去，1520年病歿於屯門。皮萊資在廣州等候期間，武宗南巡，內廷太監江彬侍帝左右，皮萊資命侍從火者亞三賄賂江彬，假充馬六甲遣送使臣，取得入京許可的皮萊資一行十三人於1520年從廣州出發，乘船北上，過韶關，穿梅嶺，到達北京，1521年全使團得以隨武宗進入北京。1521年武宗崩，江彬失去後台，不久被皇太后誅滅，皮萊資使團失去庇護者，火者亞三被捕入獄後處死。皮萊資被趕出北京，送至廣州監獄，以葡萄牙人退出馬六甲為保釋條件，但他拒絕接受，最後病死獄中。

葡萄牙人在屯門築室立寨，擄掠華人為奴，攔刧商船。1521年武宗駕崩消息傳至廣州，廣東地方根據國喪定制，要求當時在屯門的迪哥‧卡爾烏（Diogo Calvo）遠征隊退出中國，卡爾烏向明政府的海防巡邏隊發動攻擊，終於激起廣東海軍採取武力反擊，這次中葡戰爭就是著名的屯門之戰，葡萄牙人最終戰敗。

1522年葡萄牙國王又派克亭何到達屯門，其船隊駛近新會縣西草灣時，遇上中國巡邏隊，由於違抗中國巡邏隊命令，中葡又發生西草灣大戰，戰鬥從西草灣一直打到哨州（位置約在大嶼山以西，萬山群島以東），戰爭俘虜葡兵全部被處斬，這是中葡第二次戰爭，至此葡萄牙人全部逐出廣東。此後葡萄牙人來中國通商居住者，已非政府所組織，而是少數冒險商人，轉向浙江的寧波和福建的漳州。葡萄牙人到寧波後仍不改海盜與殖民本色，1542年明世宗下令討伐，命令陸軍由浙江，海軍由福建兩面夾攻寧波葡人，撃斃外國商人及天主教徒12,000人，其中葡人800人，葡人被逐出浙江後，又轉往福建漳州府同安縣月港和浯嶼，自建房屋，自設官員，掠買人口等，福建地方政府又把他們趕出月港和浯嶼。葡萄牙人艦隊退至詔安縣走馬溪，於是又發生1549年驅逐葡人出走馬溪的戰事，釋放的葡萄牙人流放廣西，部分透過賄賂又逃至廣東珠江口的上川島和浪白澳。

上川島，亦稱上川山，葡萄牙人稱聖約翰島，位於澳門西南約一百公里，其西為下川島。自西草灣之役後已經有一些葡萄牙人於1537年（嘉靖十六年）來到上川島作臨時貿易。耶穌會傳教士方濟各‧沙勿略（Franciscus Xavier）準備向中國傳教，1552年8月由日本乘葡船抵達上川島，12月病死於島上。廣東地方官員恐葡人佔領該島，遂於1554年封鎖全島，嚴禁葡人在此互市貿易，於是葡人逐漸移到浪白澳貿易。浪白澳，今稱牛角山，在三燦島之西，即在磨刀門之西南，虎跳門之東南。明清時屬黃梁都，即今南水島和北水島之間。1542年葡人已在浪白澳貿易，該地並非良港以及長居的地方，日後葡人逐步以澳門為埠。

1553年（嘉靖三十二年），葡萄牙人以需要晾曬船上被水所浸的貨物為由，登上澳門半島。1557年（嘉靖三十六年），葡人開始在澳門長期居住，並於1573年（萬曆元年）開始向明朝政府繳納地租，每年500兩白銀。1584年（萬曆十二年），居澳葡人組成議事廳，作為管理居澳葡人的行政機構。

葡萄牙的國教是天主教，天主教耶穌會的大批傳教士也伴隨商船來到澳門傳教，以傳授科學知識為傳教手段，耶穌會士也認識中國文化，彼此互相吸收，共同進步。澳門在中西科學技術及文化交流起着重要的作用，耶穌會傳教士進入內地前，要先在澳門學習中國的語言文字、中國風俗習慣，對中國儒家思想研究很深，並把中國儒家的經典書籍翻譯和註釋，送回歐洲各國出版，於是掀起歐洲人學習和研究漢學的熱潮，出現研究漢學的組織，中國傳統文化得以在歐洲傳播。