明代中叶，内忧外患交困，外交政策在“禁海”与“开海”之间长期摇摆不定，此时欧洲人已经由海上探险发现新航路，从海路长驱东来。葡萄牙位于欧洲西南面的伊比利亚半岛西部。葡萄牙亨利王子（Henry the Navigator，1394—1460年）积极推动葡萄牙人航海事业，创办航海学校，派人沿非洲西海岸南下探险。

1517年（明正德十二年），安德烈（Fernão Perez de Andrade）为发现中国总指挥，在葡萄牙国王使者皮莱资（Tomé Pires）的陪同下，向中国进发，到达屯门港，后进入广州，1518年安德烈把皮莱资等七个葡人留在广州等待明政府接见，自己则退回屯门去，1520年病殁于屯门。皮莱资在广州等候期间，武宗南巡，内廷太监江彬侍帝左右，皮莱资命侍从火者亚三贿赂江彬，假充马六甲遣送使臣，取得入京许可的皮莱资一行十三人于1520年从广州出发，乘船北上，过韶关，穿梅岭，到达北京，1521年全使团得以随武宗进入北京。1521年武宗崩，江彬失去后台，不久被皇太后诛灭，皮莱资使团失去庇护者，火者亚三被捕入狱后处死。皮莱资被赶出北京，送至广州监狱，以葡萄牙人退出马六甲为保释条件，但他拒绝接受，最后病死狱中。　

葡萄牙人在屯门筑室立寨，掳掠华人为奴，拦刧商船。1521年武宗驾崩消息传至广州，广东地方根据国丧定制，要求当时在屯门的迪哥‧卡尔乌（Diogo Calvo）远征队退出中国，卡尔乌向明政府的海防巡逻队发动攻击，终于激起广东海军采取武力反击，这次中葡战争就是著名的屯门之战，葡萄牙人最终战败。

1522年葡萄牙国王又派克亭何到达屯门，其船队驶近新会县西草湾时，遇上中国巡逻队，由于违抗中国巡逻队命令，中葡又发生西草湾大战，战斗从西草湾一直打到哨州（位置约在大屿山以西，万山群岛以东），战争俘虏葡兵全部被处斩，这是中葡第二次战争，至此葡萄牙人全部逐出广东。此后葡萄牙人来中国通商居住者，已非政府所组织，而是少数冒险商人，转向浙江的宁波和福建的漳州。葡萄牙人到宁波后仍不改海盗与殖民本色，1542年明世宗下令讨伐，命令陆军由浙江，海军由福建两面夹攻宁波葡人，撃毙外国商人及天主教徒12,000人，其中葡人800人，葡人被逐出浙江后，又转往福建漳州府同安县月港和浯屿，自建房屋，自设官员，掠买人口等，福建地方政府又把他们赶出月港和浯屿。葡萄牙人舰队退至诏安县走马溪，于是又发生1549年驱逐葡人出走马溪的战事，释放的葡萄牙人流放广西，部分透过贿赂又逃至广东珠江口的上川岛和浪白澳。

上川岛，亦称上川山，葡萄牙人称圣约翰岛，位于澳门西南约一百公里，其西为下川岛。自西草湾之役后已经有一些葡萄牙人于1537年（嘉靖十六年）来到上川岛作临时贸易。耶稣会传教士方济各‧沙勿略（Franciscus Xavier）准备向中国传教，1552年8月由日本乘葡船抵达上川岛，12月病死于岛上。广东地方官员恐葡人占领该岛，遂于1554年封锁全岛，严禁葡人在此互市贸易，于是葡人逐渐移到浪白澳贸易。浪白澳，今称牛角山，在三灿岛之西，即在磨刀门之西南，虎跳门之东南。明清时属黄梁都，即今南水岛和北水岛之间。1542年葡人已在浪白澳贸易，该地并非良港以及长居的地方，日后葡人逐步以澳门为埠。

1553年（嘉靖三十二年），葡萄牙人以需要晾晒船上被水所浸的货物为由，登上澳门半岛。1557年（嘉靖三十六年），葡人开始在澳门长期居住，并于1573年（万历元年）开始向明朝政府缴纳地租，每年500两白银。1584年（万历十二年），居澳葡人组成议事厅，作为管理居澳葡人的行政机构。

葡萄牙的国教是天主教，天主教耶稣会的大批传教士也伴随商船来到澳门传教，以传授科学知识为传教手段，耶稣会士也认识中国文化，彼此互相吸收，共同进步。澳门在中西科学技术及文化交流起着重要的作用，耶稣会传教士进入内地前，要先在澳门学习中国的语言文字、中国风俗习惯，对中国儒家思想研究很深，并把中国儒家的经典书籍翻译和注释，送回欧洲各国出版，于是掀起欧洲人学习和研究汉学的热潮，出现研究汉学的组织，中国传统文化得以在欧洲传播。