北京大学是全国最高学府，蔡元培在1916年12月底接任校长之职，翌年1月初就职。他先后聘用陈独秀为文科学长、李大钊为图书馆主任。1918年间，蔡元培在北大发起组织进德会，并开办校役夜班，还发起成立新闻学研究会。12月，蔡元培为《北京大学月刊》撰写发刊词，倡导“思想自由，兼容并包”，破除“学生专己守残之陋习”，这确立了北大自由、宽松的学术环境。1919年发生的五四运动，则成为了蔡元培人生中及北大校史上备受瞩目的重要事件。

第一次世界大战结束后，各国在巴黎召开和平会议。中国因为曾经向德国宣战，是战胜国之一，但日本则坚称德国以前在山东获得的全部权利应由日本继承，并提出中国政府曾经表示“欣然同意”的换文，中国代表在巴黎和会中力争权益的行动，结果宣告失败。

从1919年4月下旬开始，巴黎和会的消息传到中国，国人十分愤慨，已有请愿行动，矛头直指北洋政府的亲日派官员。及至得知段祺瑞政府早在1918年与日本秘密订立山东问题换文，果然真有“欣然同意”字句，于是群情更加激动。

5月3日，蔡元培从外交委员长汪大燮处获悉巴黎和会中国外交失败，政府准备在丧权辱国的和约上签字的消息，他旋即告知北大学生代表。5月4日，北京大学及其他大、中学校学生共三千多人，在天安门前集会，提出“外争国权，内除国贼”的口号。集会结束后，学生游行到使馆区交请愿书，要求英、美不要偏袒日本，但行动为军警所阻，后来演变成为过激行动，群众捣毁交通总长曹汝霖的住宅，殴打另一名官员章宗祥，军警拘捕了三十多名学生，史称“五四事件”。

当晚，蔡元培出席北京大学学生为营救被捕学生而召开的大会。5日及6日，他与北京其他高校校长开会讨论如何营救被捕学生，并在6日下午，与各校校长同往教育部及警察厅，要求释放学生。第二天，他率领全部师生欢迎和慰勉获释学生

五四事件的消息传出后，各大城市均有学生响应罢课，工人发动罢工，商人抵制日货和罢市。至此，学生爱国运动遂发展成为包括各阶层民众在内的全国性运动，汇为五四运动的洪流，影响深远。结果，北洋政府于6月5日释放所有被捕学生，免去三名亲日官员的职务，饬令巴黎的中国代表拒绝在和约上签字。

五四运动激发了青年对国家民族的爱护和责任感，在对外方面是反帝国主义的表现，在文化方面也有特殊的意义。早从1915年开始，中国学界已经展开了一个新文化运动，陈独秀创办《青年杂志》（第二年改名《新青年》），胡适、李大钊、鲁迅（周树人）等人先后参加编撰和撰稿工作，蔡元培积极支持，遂使北京大学这所全国最高学府，成为新思潮的策源地。正因如此，新文化运动与其后的五四运动结下不解之缘，而有“五四新文化”之名，甚至把两者合称为“五四新文化运动”。新文化运动促进了五四运动的出现，五四运动反过来把新文化运动推向高峰。

蔡元培在1919年5月4日当天曾劝学生不要到天安门去，事发之后表示不赞成学生过激的行动。学生被捕后，他又作为代表，为营救学生而四处奔走，直至学生释放出来为止。事后，蔡元培请辞，但在各方挽留下复任。他表示希望学生安心求学，以科学救国思想，养成模范人格，“力学报国”。在有余暇时，可以服务社会，担负指导平民的责任，尽力于平民教育，预备将来解决中国一时尚未能解决的大问题。

蔡元培一向强调教育的重要性，认为任何救国救时的方案，如果缺乏教育专业的支援，都可能大打折扣。有些人批评他缓不济急，但他认为振兴国家民族是百年大业，急不来的。蔡元培语重心长的话，相信就是五四运动深层的真谛，在一个世纪之后，彰彰明甚。今日重提蔡元培及五四运动，其意义也在于此。