北京大學是全國最高學府，蔡元培在1916年12月底接任校長之職，翌年1月初就職。他先後聘用陳獨秀為文科學長、李大釗為圖書館主任。1918年間，蔡元培在北大發起組織進德會，並開辦校役夜班，還發起成立新聞學研究會。12月，蔡元培為《北京大學月刊》撰寫發刊詞，倡導「思想自由，兼容並包」，破除「學生專己守殘之陋習」，這確立了北大自由、寬鬆的學術環境。1919年發生的五四運動，則成為了蔡元培人生中及北大校史上備受矚目的重要事件。

第一次世界大戰結束後，各國在巴黎召開和平會議。中國因為曾經向德國宣戰，是戰勝國之一，但日本則堅稱德國以前在山東獲得的全部權利應由日本繼承，並提出中國政府曾經表示「欣然同意」的換文，中國代表在巴黎和會中力爭權益的行動，結果宣告失敗。

從1919年4月下旬開始，巴黎和會的消息傳到中國，國人十分憤慨，已有請願行動，矛頭直指北洋政府的親日派官員。及至得知段祺瑞政府早在1918年與日本秘密訂立山東問題換文，果然真有「欣然同意」字句，於是群情更加激動。

5月3日，蔡元培從外交委員長汪大燮處獲悉巴黎和會中國外交失敗，政府準備在喪權辱國的和約上簽字的消息，他旋即告知北大學生代表。5月4日，北京大學及其他大、中學校學生共三千多人，在天安門前集會，提出「外爭國權，內除國賊」的口號。集會結束後，學生遊行到使館區交請願書，要求英、美不要偏袒日本，但行動為軍警所阻，後來演變成為過激行動，群眾搗毀交通總長曹汝霖的住宅，毆打另一名官員章宗祥，軍警拘捕了三十多名學生，史稱「五四事件」。

當晚，蔡元培出席北京大學學生為營救被捕學生而召開的大會。5日及6日，他與北京其他高校校長開會討論如何營救被捕學生，並在6日下午，與各校校長同往教育部及警察廳，要求釋放學生。第二天，他率領全部師生歡迎和慰勉獲釋學生。

五四事件的消息傳出後，各大城市均有學生響應罷課，工人發動罷工，商人抵制日貨和罷市。至此，學生愛國運動遂發展成為包括各階層民眾在內的全國性運動，匯為五四運動的洪流，影響深遠。結果，北洋政府於6月5日釋放所有被捕學生，免去三名親日官員的職務，飭令巴黎的中國代表拒絕在和約上簽字。

五四運動激發了青年對國家民族的愛護和責任感，在對外方面是反帝國主義的表現，在文化方面也有特殊的意義。早從1915年開始，中國學界已經展開了一個新文化運動，陳獨秀創辦《青年雜誌》（第二年改名《新青年》），胡適、李大釗、魯迅（周樹人）等人先後參加編撰和撰稿工作，蔡元培積極支持，遂使北京大學這所全國最高學府，成為新思潮的策源地。正因如此，新文化運動與其後的五四運動結下不解之緣，而有「五四新文化」之名，甚至把兩者合稱為「五四新文化運動」。新文化運動促進了五四運動的出現，五四運動反過來把新文化運動推向高峰。

蔡元培在1919年5月4日當天曾勸學生不要到天安門去，事發之後表示不贊成學生過激的行動。學生被捕後，他又作為代表，為營救學生而四處奔走，直至學生釋放出來為止。事後，蔡元培請辭，但在各方挽留下復任。他表示希望學生安心求學，以科學救國思想，養成模範人格，「力學報國」。在有餘暇時，可以服務社會，擔負指導平民的責任，盡力於平民教育，預備將來解決中國一時尚未能解決的大問題。

蔡元培一向強調教育的重要性，認為任何救國救時的方案，如果缺乏教育專業的支援，都可能大打折扣。有些人批評他緩不濟急，但他認為振興國家民族是百年大業，急不來的。蔡元培語重心長的話，相信就是五四運動深層的真諦，在一個世紀之後，彰彰明甚。今日重提蔡元培及五四運動，其意義也在於此。