日本发动全面战争，中华民族处于危急存亡的关头。1937年7月17日，蒋介石在庐山发表谈话：“芦沟桥事变的推演，是关系中国国家整个的问题”。他因此要求：“地无分南北，人无分老幼，无论何人，皆有守土抗战之责任。”8月14日，国民政府发表《自卫抗战声明书》，实行自卫。为此，周恩来代表中共中央也递交了《为公布国共合作宣言》。8月22日，共产党的红军改编为“八路军”。9月22日，国民党中央通讯社发表了《中国共产党为公布国共合作宣言》。23日，蒋介石发表谈话响应。这样，是继1924年国共第一次合作后，国共两党再次合作，“抗日民族统一战线”正式形成。

红军被改编成“八路军”，立即开赴华北战场，与国民党军队协同抗日。1937年9月24日，八路军第一一五师冒雨设伏于平型关东北公路的两侧山地，待日军板垣师团第二十一旅团进入伏击圈后，发起猛攻。经一天激战，共歼敌千多人，缴获大量武器和军备，取得了抗战以来第一次大胜利。八路军继而马不停蹄赶到忻口，配合国民党军队作战。10月，日本集中七万兵力，在大量飞机、战车和重炮的支持下，向忻口猛攻，企图迅速拿下太原。中国守军奋勇抵抗，共歼灭日军约两万人。中国军队也伤亡十万以上，第九军军长郝梦龄、第五十四师师长刘家麒壮烈牺牲。

抗战进入相持阶段，国共关系逐步恶化。国民党在保持抗日之余，也关注中共力量日益壮大。1939年1月召开了国民党五届五中全会，是国民党调整政策的一个重要标志。该会确定了“防共、限共、溶共”方针，并成立“防共委员会”。1939年底至1940年春，国共两党在陕、甘、宁、山西，以及冀南、豫北一带发生多次武装冲突。在冲突中，八路军打退国民党军的进攻，收复了被占地区，并且驱逐了部分地区的国民党官员。这次冲突虽在事后和解，但两党之间的不信任并没有消除。

由于国民党眼见中共扩大根据地和中共军力增强，从1940年春起，国民党与共产党的军队在华中出现多次冲突。1940年7月，国民党提出“中央提示案”，要求取消陕、甘、宁边区，限制八路军、新四军的发展和作战区域。中共拒绝接受国民党的提示，两党在华中对峙。面对这种情况，中共决定将新四军撤至黄河以北。1941年1月，新四军开始北移。1月5日，新四军在安徽茂林地区遭国民党军顾祝同部伏击。1月14日，新四军阵地被国民党军占领，全军九千余人仅二千余人突出重围，军长叶挺被扣押，政治委员项英遇害。这就是震惊全国的“皖南事变”。皖南事变遭到全国民众谴责。新四军于1月20日重建军部。新四军的代理军长为陈毅，政委为刘少奇。自“皖南事变”后，在苏联、英国及美国的共同干预下，国共两党并未彻底分裂。