1927年10月3日，魯迅由廣州抵達上海，傾全力從事文學活動。魯迅在上海時期出版的著作，有回憶散文集《朝花夕拾》，雜文集《而已集》、《三閒集》、《二心集》等，歷史小說集《故事新編》，以及通訊集《兩地書》。此外，魯迅還翻譯了俄國作家果戈里的長篇小說《死魂靈》，以及《藝術論》等新興文藝理論著作。

魯迅在上海時期，先後參加了左翼作家聯盟、自由大同盟和中國民權保障同盟，成為共產黨的忠誠友人，抗日民族統一戰線政策的熱烈擁護者。許廣平，廣東番禺人，1923年10月與魯迅相識，後來兩人開始同居，最後成為他的伴侶。他們患難與共，甘苦相知，共同度過了充滿艱辛危難的崢嶸歲月。魯迅後十年的著作成績超過了此前的二十年，其中就包含了許廣平的智慧與辛勞。魯迅去世後，許廣平為保存魯迅文物、出版魯迅全集、弘揚魯迅精神作出了重大貢獻。

1930年3月2日，中國現代文學史上的著名革命文學團體──中國左翼作家聯盟在上海成立，魯迅參加了左聯的籌備工作，並被選為常務委員。魯迅在會上發表了重要講話，號召左翼作家在為工農大眾的共同目標下團結起來。魯迅多次嚴肅批評左翼內部的教條主義及宗派主義，同時關心、培養、提攜了很多進步的文學青年，被公認為左翼文壇的盟主。

1930年3月1日，魯迅與郁達夫、潘漢年、田漢等五十一人聯名發起成立中國自由運動大同盟，反對國民黨政權查禁書報，檢查新聞，鎮壓勞苦群眾為求生存而進行的罷工抗租行動。宣言指出：「自由是人類的第二生命，不自由，毋寧死！」魯迅因此被國民黨浙江省黨部冠以「墮落文人」的罪名，呈請南京政府通緝。1933年1月11日，魯迅加入宋慶齡、蔡元培領導的中國民權保障同盟；同月18日，被選為同盟上海分會執行委員；5月13日，與宋慶齡等赴德國駐滬領事館抗議德國法西斯的恐怖主義行徑。6月，同盟總幹事楊銓被暗殺，同盟活動中止。

1936年10月19日凌晨5時25分，魯迅病逝於上海大陸新村寓所，終年56歲。當天下午，魯迅遺體移至上海膠州路萬國殯儀館。上海156個團體的近萬名群眾絡繹不絕地前來瞻仰魯迅遺容，成千上萬民眾自發地為魯迅送葬。22日下午4時半左右，魯迅靈柩入墓穴。上海民眾代表將一面白地黑字錦旗覆蓋在魯迅棺木上，旗上由沈鈞儒題寫了「民族魂」三個大字，現場不斷呼叫口號：「魯迅先生不死，中華民族永生！」